細(xì)胞培養(yǎng)被支原體污染是個(gè)世界性問題，在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%。支原體是一類無細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，為圓形、絲狀或梨形，其直徑僅有0.13～0.18μm，變形能力大，故能通過濾菌器，突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明，支原體能耗盡營(yíng)養(yǎng)物，促進(jìn)代謝積累，導(dǎo)致pH改變，對(duì)細(xì)胞造成多種影響，包括生長(zhǎng)狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細(xì)胞存活等多方面的改變，繼而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，或造成無法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細(xì)胞幾乎是不可能的。下面介紹了幾種檢測(cè)方式，或許對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有用。
1、分離培養(yǎng)法
分離培養(yǎng)法是支原體檢測(cè)的金標(biāo)方法，其檢測(cè)精確度最高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上生長(zhǎng)，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。
但是，分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. hyorhinis。
2、DNA檢測(cè)法，也稱直接培養(yǎng)法
將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測(cè)所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細(xì)胞的核周圍觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。
但是這種方法靈敏度太低，當(dāng)檢測(cè)成陽性時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。且Hoechst熒光染色：操作復(fù)雜，操作不當(dāng)易造成假陽性或假陰性。
3、PCR法
市面上有許多商機(jī)提供基于PCR的支原體檢測(cè)試劑盒，如GeneCopoeia。這種方法已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用的范圍也較為廣泛。
PCR法采用針對(duì)支原體DNA的引物用PCR檢測(cè)可疑樣本，其PCR引物可特異擴(kuò)增支原體基因組中rDNA保守序列，包括所有已知的支原體，及細(xì)胞培養(yǎng)過程普遍遇到的種屬，例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。
PCR法快速，簡(jiǎn)便，具有強(qiáng)擴(kuò)增能力和高的敏感性，可以檢測(cè)大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見最好同時(shí)使用另一種檢測(cè)方法來進(jìn)行驗(yàn)證。PCR法檢測(cè)支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測(cè)方法。
4、酶學(xué)檢測(cè)
酶學(xué)檢測(cè)是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。
最后，建議你進(jìn)行定期檢測(cè)。
支原體感染會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，因此對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)非常重要。一般來說每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測(cè)。將定期支原體檢測(cè)常規(guī)化堅(jiān)持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)支原體感染的關(guān)鍵。
通常來說，被污染的細(xì)胞應(yīng)該丟棄，以避免成為污染源。但對(duì)于珍貴的細(xì)胞，以往別的品牌的支原體清除劑，其實(shí)只是抑制劑，它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成，但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌，可與支原體膜特異性結(jié)合，破壞膜通透性，導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。
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