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分述ELISA常見問題與解決方法
  • 發(fā)布日期:2022-10-17      瀏覽次數(shù):553
    • ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式,測定操作非常簡單,一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面,其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果,且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?,F(xiàn)分述ELISA常見問題與解決方法:

      1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

      ①  樣品、試劑被污染,或加樣時操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑,小心操作。

      ② 酶標(biāo)板洗滌不*——洗板前先將抗體溶液倒干凈,然后清洗液倒?jié)M板孔,確保能充分洗滌。

      ③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體,稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

      2.酶標(biāo)板整體背景高

      ① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

      ② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當(dāng)稀釋。

      ③ 反應(yīng)時間過長——當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng),適當(dāng)縮短顯色時間。

      ④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的,若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染,應(yīng)更換新的底物溶液。

      ⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。

      3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

      ① 樣品數(shù)量不整齊,加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。

      ② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,并且使用同一移液槍。

      ③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時,操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

      4. 吸光值偏高或偏低

      ① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

      ② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量。

      ③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間,確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。

      ④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進行孵育(一般37℃孵育1h)。


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